Geräteausstattung

Das Autoflex III (Bruker Daltonics) ist ein orthogonales MALDI-TOF-TOF-System, das eine Identifizierung von Biomolekülen über die exakte Bestimmung der Molekülmasse ermöglicht. Das Gerät erreicht z.B. für Peptide eine Massengenauigkeit von bis zu 5 ppm (bei m/z = 1000 Da entspricht dies einer Abweichung von +/- 0,005 Da). Außerdem kann durch eine gezielte Fragmentierung von Biomolekülen (MS/MS-Analyse) die über die Massenbestimmung erhaltene Identifizierung verifiziert werden. Aufgrund der robusten und einfachen Art der Probenvorbereitung lässt sich die MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die Analyse von diversen Substanzklassen einsetzen.

Einsatzbereiche:

• Identifizierung von Proteinen aus 1D-, 2D- oder 2D-DIGE-Gelen (PMF, Peptidmassenfingerprint)
• Massenbestimmung von Peptiden, Proteinen, Oligosacchariden, Lipiden etc. zur Qualitätskontrolle bzw. Identifizierung
• Top-Down-Analyse (N-terminale Sequenzierung) von intakten Proteinen über MALDI-ISD (In Source Decay)

Für eine detaillierte Charakterisierung von (komplexen) Proteinextrakten stehen zwei FT-ESI-Massenspektrometer zur Verfügung. Die beiden Geräte sind jeweils mit einer nano-UHPLC Anlage gekoppelt, die eine chromatographische Auftrennung der Peptide vor der massenspektrometrischen Analyse ermöglicht. 

Das LTQ Orbitrap XL Fourier-Transformationsmassenspektrometer (Thermo Fischer Scientific) zeichnet sich durch eine sehr hohe Massengenauigkeit (≤ 1 ppm bei interner Kalibrierung), hohe Auflösung (bis zu 100.000) und Sensitivität aus, was zu einer eindeutigeren Identifizierung von Proteinen und ihrer Modifikationen führt als bei Massenspektrometern mit geringer Massengenauigkeit und Auflösung. Das Gerät besitzt zwei Analysatoren die parallel arbeiten, eine lineare Ionenfalle (LTQ) mit hoher Scangeschwindigkeit und einen Orbitrap Analysator mit hoher Auflösung und Massengenauigkeit. Zudem verfügt das Gerät über verschiedene Möglichkeiten, Peptide und Proteine zu fragmentieren (CID, HCD), wodurch umfangreiche Sequenzinformationen erhalten werden können. Die Orbitrap XL ist an eine nano-UHPLC-Anlage (EASY-nLC 1200, Thermo Fisher Scientific) gekoppelt, die Flussraten im Bereich von 200 nl/min bis 100 µl/min erzeugen kann und mit Nano-HPLC-Säulen (innerer Durchmesser 75  µm) betrieben wird. Die Verwendung geringer Flussraten ermöglicht eine höhere Sensitivität für die Analyse von Peptiden und Proteinen.

Für die Analyse von hochkomplexen Proteingemischen besteht die Möglichkeit, Analysen an einem Q-Exactive Plus Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) durchzuführen, das im Fachgebiet "Systembiologie der Pflanze" (260b, Prof. Waltraud Schulze) aufgestellt ist. Das Gerät wird zusammen mit einer nano-UHPLC-Anlage (EASY-nLC 1000, Thermo Fisher Scientific) betrieben und wird ausschließlich für die Proteinanalytik eingesetzt. Im Gegensatz zur Orbitrap XL verfügt das Q-Exactive Plus MS über einen Orbitrap-Analysator neuerer Bauart, der eine schnellere Akquirierung von MS- und MS/MS-Spektren ermöglicht. Hierdurch lassen sich in hochkomplexen Proben mehr Proteine identifizieren und quantifizieren als mit dem Orbitrap-XL-System. Zudem verfügt das Q-Exactive MS-System noch über einen Isolations-Quadrupol, der es ermöglicht, SIM- (Single Ion Monitoring) oder SRM- (Selected Reaction Monitoring)-ähnliche Experimente durchzuführen. Hierduch können einzelne Proteine oder Peptide gezielt quantifiziert werden, wobei eine vergleichbare Sensitivität wie an einem Tripel-Quadrupol- oder QTRAP MS-System erreicht werden kann.

Einsatzbereiche für beide nano-LC-ESI-MS/MS-Geräte:

• exakte, hochauflösende Massenbestimmung von Peptiden und Proteinen
• Identifizierung von Proteinen aus komplexen Gemischen
• Identifizierung von posttranslationalen Proteinmodifikationen
• relative und absolute Quantifizierung von Proteinen (mit und ohne Isotopenmarkierung)
• gezielte Quantifizierung von Proteinen oder Peptiden über SIM- oder PRM- (Parallel Reaction Monitoring)-Experimente (nur Q-Exactive Plus)

Für die Analytik von Peptiden und Proteinen stehen zudem folgende Software-Pakete zur Verfügung:

• Mascot Server 2.6 (Matrix Science)
• Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Scientific)
• Scaffold 4.6.1 (Proteome Software)
• MaxQuant 1.5.5.1 (MPI für Biochemie, AG Cox/Mann)
• Perseus 1.5.5.3 (MPI für Biochemie, AG Cox/Mann)
• Progenesis LCMS 4.1.4 (Nonlinear Dynamics)

Das 5500 QTRAP-Massenspektrometer (AB SCIEX) wird  für die quantitative Analyse von Metaboliten und Proteinen eingesetzt. Mit diesem Gerät können Metaboliten mit bekannter Masse bzw. Proteine mit bekannter Sequenz in komplexen Gemischen über SRM-(Selected Reaction Monitoring) oder MRM- (Multiple Reaction Monitoring)-Experimente selektiv nachgewiesen und quantifiziert werden. In einem SRM-Experiment werden Paare von Vorläufer- und Fragmentionen (sog. SRM-Übergänge) analysiert, die charakteristisch für einen Metaboliten oder ein Peptid sind. Hierbei wird sowohl auf der Ebene der Vorläuferionen als auch bei der Analyse der Fragmentionen nur ein sehr kleiner Massenbereich selektiert, wodurch der chemische Hintergrund reduziert und eine deutliche Erhöhung der Sensitivität bewirkt wird. Im Gegensatz zu reinen Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern handelt es sich bei der 5500 QTRAP um ein Hybrid-System aus Tripel-Quadrupol und linearer Ionenfalle. Daher können an der 5500 QTRAP auch während eines SRM-Experimentes Fragmentierungsspektren in der Ionenfalle (MS/MS oder MS³) akquiriert werden, die zur Verifizierung des Metaboliten/Peptides herangezogen werden können.

Ein weiterer Einsatzbereich des QTRAP-Massenspektrometers besteht im Screening auf das Vorhandensein von bestimmten Substanzklassen oder Modifikationen (z.B. Lipide, Glykosylierungen, Phosphorylierungen etc. ), die mit Hilfe von Vorläuferionen oder Neutralverlust-Scans durchgeführt werden können. Auch hier besteht die Möglichkeit innerhalb des Screening-Experimentes datenabhängig Fragmentierungsspektren zu erzeugen, die zu einer Identifizierung von Metaboliten oder Peptiden führen können.

Für die Analytik von Proteinen wird das 5500 QTRAP-Massenspektrometer mit einer nanoUHPLC-Anlage betrieben, während das Gerät für die Analytik von Metaboliten an eine 1290 Infinity UHPLC-Anlage (Agilent) gekoppelt wird. Die 1290 Infinity-Anlage lässt sich bei einem Rückdruck von bis zu 1200 bar (bei Flussraten von ≤ 2ml/min) betreiben, wodurch sich die Säulenmaterialien mit Partikelgrößen < 2µm effektiv nutzen lassen. Durch die Verwendung von Säulenmaterialien mit kleineren Partikelgrößen können höhere Peak-Kapazitäten und MS-Signalintensitäten im Vergleich zu konventionellen HPLC-Anlagen erzielt werden.

Einsatzbereiche:

• relative Quantifizierung von Metaboliten und Proteinen über SRM-/MRM-Experimente
• absolute Quantifizierung von Metaboliten und Proteinen über SRM-/MRM-Experimente (mit Isotopenmarkierung)
• Vorläuferionen- oder Neutralverlust-Screening-Experimente für die Identifizierung von bestimmten Substanzklassen oder Modifikationen in komplexen Proben

Seit September 2016 steht der CFH für die Analyse von niedermolekularen Substanzen und Metaboliten ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung und Massengenauigkeit zur Verfügung, das zusammen mit einer 1290 Infinity-UHPLC-Anlage (Agilent) betrieben wird.

Das Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific)-Massenspektrometer erreicht Auflösungen von bis zu 140.000 (bei m/z = 200) und besitzt eine hohe Massengenauigkeit für MS-Spektren (≤ 1 ppm bei interner Kalibrierung) und Fragmentierungsspektren (MS/MS-Spektren). Dies ermöglicht die präzise Bestimmung des m/z-Verhältnisses einer Substanz und damit die Generierung eines zuverlässigen Summenformel-Vorschlages, was häufig der erste Schritt zur Identifizierung von unbekannten Substanzen bzw. zum Nachweis einer Substanz ist. MS/MS-Spektren können als weiteres Kriterium für die Substanzidentifizierung und Strukturaufklärung herangezogen werden, sofern Datenbanken mit Referenzspektren oder Standardsubstanzen vorhanden sind. Die hohe Massengenauigkeit des Q-Exactive Plus MS im MS/MS-Modus ermöglicht hier eine eindeutige Zuordnung zu Referenzspektren.

Das Q-Exactive Plus MS verfügt zudem über einen hohen dynamischen Bereich (4-5 Größenordnungen) und eine hohe Scangeschwindigkeit im MS- und MS/MS-Modus. Dies ermöglicht es, viele Substanzen in einer Analyse zu erfassen und gleichzeitig genügend Datenpunkte für eine präzise Quantifizierung zu erhalten. Diese Eigenschaften sind vor allem für Metaboliten-Profiling- oder Metaboliten-Fingerprint-Experimente von Bedeutung. Bei dieser Art von Experimenten wird versucht, in komplexen biologischen Proben ein möglichst breites Spektrum von Substanzen zu detektieren, identifizieren und (relativ) zu quantifizieren. Vergleiche von Metabolitenprofilen eines biologischen Systems unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen dann ein besseres Verständnis der Regulationsvorgänge in diesem System.

 Einsatzbereiche:

• Identifizierung von Metaboliten über die Bestimmung der exakten Molekülmasse
• Metaboliten-Profiling/Metabolomics (relative Quantifizierung von Metaboliten)
• gezielte (absolute) Quantifizierung von Metaboliten über SIM- oder PRM (Parallel Reaction Monitoring)-Experimente

Für die Durchführung von 2D-Elektrophorese- bzw. 2D-DIGE-Experimenten im Hochdurchsatz stehen ein Verdauroboter (DigestPro MSi, Intavis) und ein Spotpicker (Ettan Spot Picker, GE Healthcare) zur Verfügung. Mit Hilfe dieser Geräte lassen sich bis zu 96 Proben über Nacht über einen in Gel Verdau für die anschließende massenspektrometrische Analyse mittels MALDI-TOF oder LC-ESI-MS/MS vorbereiten. Die weitere Probenvorbereitung für eine MALDI-TOF-Analyse (ZipTip-Präparation auf ein MALDI-Target) kann ebenfalls automatisiert werden.

Der GenePix 4000B Microarray Scanner (Molecular Devices) ermöglicht die Akquisition von fluoreszierenden DNA- und Proteinarrays auf Standard-Mikroskopie-Glasobjektträgern (25 mm x 75 mm). Das Gerät verfügt über zwei Laser mit den Anregungswellenlängen 532 nm und 635 nm, mit denen simultan gescannt werden kann. Als Fluoreszenzfarbstoffe für eine Markierung der Proben sind alle Farbstoffe geeignet, die sich mit den beiden Lasern anregen lassen (Cy3, Alexa532, Cy5, Alexa633 etc.). Für die Auswertung der Daten stehen zwei Softwarepakete zur Verfügung: GenePixPro ermöglicht die Aufnahme der Daten und die erste Stufe der Auswertung (Auffinden der Features, Normalisierung). Eine weitergehende statistische Analyse und Vergleiche eigener Arrays mit Fremddaten (z.B. auch Affimetrix) kann mit der Acuity-Software durchgeführt werden. Hybridisierungskammern für die Hybridisierung von Microarrays können auf Anfrage kostenlos zur Verfügung gestellt werden.

Für die Durchführung von 2D-Elektrophorese-Experimenten ist ein System für die isoelektrische Fokussierung von Proteinen (IPGphor3, GE Healthcare) und eine vertikale Elektrophoreseeinheit (Ettan DALTsix, GE Healthcare) für große Gele (26 x 20 cm) vorhanden. In der ersten Dimension (IEF) können sämtliche verfügbare Längen an IPG-Streifen (7-24 cm) verwendet werden. Dabei können bis zu 12 IPG-Streifen gleichen Typs parallel prozessiert werden. In der zweiten Dimension (SDS-PAGE) können in der Ettan Daltsix-Elektrophoreseeinheit Trennungen auf bis zu sechs großen Gelen gleichzeitig durchgeführt werden.

Das Typhoon Trio+ Imaging System (GE Healthcare) wird vornehmlich für Fluoreszenzanalysen von Gelen, Blots oder Zellkulturplatten eingesetzt. Das Gerät verfügt über 3 Laser mit den Anregungswellenlängen 488 nm (blau), 532 nm (grün) und 633 nm (rot) sowie über entsprechende Emissionsfilter. Dies ermöglicht die Applikation einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Fluorophoren. Zudem ist die Analyse von bis zu vier Fluorophoren in einer Probe („Multiplexing“) möglich. Multiplexing wird z.B. bei der Durchführung von differenziellen Protein-Expressionsanalysen mittels 2D DIGE eingesetzt.

Weitere Applikationsmöglichkeiten:

- Autoradiographie: (mit Storage Phosphor Screen Platten) diverser Radioisotope: 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I

- Chemilumineszenz: direkte Detektion von Chemilumineszenz ohne Auflegen eines Films oder Screens z.B. von Western Blots.

Die Analyse der Daten kann mit der ImageQuantTL Software durchgeführt werden. Softwarepakete für die quantitative Analyse und die statistische Auswertung von 2D-Gelen bzw. 2D DIGE-Gelen sind ebenfalls vorhanden (Progenesis SameSpots 4.1.3).