FAQ

Welche Informationen über Ihre Probe sollten Sie beifügen?

Informationen über Struktur, Sequenz, chemische Reaktivitäten, pH-Wert, Verunreinigungen, verwendete Lösungsmittel, etc. erleichtern die Bearbeitung der Proben und beschleunigen den Analyseprozess. Je ausführlicher die Informationen über die Probe sind, desto besser! Verwenden Sie bitte für Ihre Angaben unser Probenformular und geben Sie die Probe mit dem ausgefüllten Probenformular bei uns ab. Für eine Identifizierung von Proteinen aus Gelen fügen Sie dem Probenformular bitte ein Bild des Gels, auf dem die zu analysierenden Banden bzw. Spots markiert sind, bei. Für die Analyse von Metaboliten können Sie (falls vorhanden) eigene Vorarbeiten wie die chromatographische Trennung eines Extraktes auf der eigenen HPLC inklusive der verwendeten HPLC-Parameter beifügen.

Welche Moleküle lassen sich mittels MALDI-MS und ESI-MS analysieren?

Die Ionisierung der Probenmoleküle erfolgt beim MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)-MS durch Laserbeschuss von Kokristallen aus einer Matrixsubstanz und Probenmolekülen. Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) erfolgt die Ionisierung aus der flüssigen Phase durch Anlegen eines elektrischen Feldes und Verdampfung des Lösungsmittels. Prinzipiell sind alle Moleküle detektierbar, die sich mit diesen beiden Ionisierungsmechanismen ionisieren lassen und in ausreichender Konzentration vorliegen. Schwierigkeiten bereiten Moleküle die keinerlei funktionellen Gruppen besitzen die eine positive Ladung oder eine negative Ladung aufweisen können (z.B. Alkane). Solche Substanzen lassen sich häufig besser über GC (Gas Chromatography)-MS analysieren. Bei der MALDI-MS Methode bestehen außerdem Einschränkungen hinsichtlich des Molekulargewichtes der Probenmoleküle: bei Substanzen mit einem Molekulargewicht ≤ 600 kann es zu Überlagerung oder Unterdrückung der Probensignale durch Matrixsignale kommen.

Welche Probenmenge ist für eine Massenbestimmung mittels MALDI-TOF oder ESI-MS erforderlich?

Die Konzentration für eine Massenbestimmung von Proteinen sollte bei 1-50 pmol/µl liegen, bei einem Mindestvolumen von 5 µl. Für Peptide sind 1-10 pmol/µl ausreichend, ebenfalls in mindestens 5 µl Lösung. Modifizierte Proteine und Peptide (z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung etc.) werden häufig mit geringerer Effektivität ionisiert, daher sollten für diese Substanzen die Konzentrationen nicht an der Untergrenze der oben angegebenen Bereiche liegen. Für eine Analyse von Metaboliten lassen sich aufgrund der unterschiedlichen Struktur und Ionisierungseffizienz der verschiedenen Substanzklassen keine generellen Konzentrationsbereiche für eine Detektion angeben. Viele Metaboliten lassen sich aber in einem Konzentrationsbereich 1-100 µg/ml  gut erfassen.

Welche Anforderungen werden an die Reinheit der Probe gestellt?

Bitte versuchen Sie bei der Probenvorbereitung Puffer mit ionischen Detergenzien wie z.B. SDS, CHAPS oder schwerflüchtige Lösungsmittel wie DMSO zu vermeiden. Ebenfalls kritisch sind Glyzerin, Polyethylenglycol (PEG) und Detergenzien wie z.B. Tween20, NP40 oder TritonX100, da diese Substanzen auch selbst leicht ionisieren und intensive Ionensignale erzeugen, die oft die Signale der Probenmoleküle vollständig unterdrücken. Für ESI-Messungen sind die Anforderungen an die Reinheit der Probe noch höher, da die Supressionseffekte in größerem Umfang auftreten als bei MALDI-TOF Analysen. Sollten die erwähnten Chemikalien für die Probenaufarbeitung unbedingt erforderlich sein, müssen sie vor der massenspektrometrischen Analyse durch geeignete Reinigungsschritte (RP-HPLC, SPE) entfernt werden.

Salze und Puffersubstanzen wie Natriumchlorid, Phosphate, Tris oder Harnstoff sind in höheren Konzentrationen (≥ 10 mM) ebenfalls kritisch. Diese Substanzen unterdrücken die Ionisierung der Probenmoleküle nicht, bilden aber Addukte mit den Probenmolekülen, die als zusätzliche Signale im Massenspektrum auftreten. Dadurch wird die Interpretation der Spektren unnötig erschwert oder im schlimmsten Fall unmöglich. Daher benutzen Sie bitte wenn möglich, flüchtige Puffersubstanzen wie Ammoniumhydrogencarbonat, Ammoniumacetat oder Ammoniumformiat. Als Lösungsmittel sind flüchtige Lösungsmittel wie Wasser, Acetonitril, Methanol oder Isopropanol zur Probenvorbereitung geeignet.

Was ist zu beachten, wenn ich Proteine aus Gelbanden identifizieren will?

Die Proteinbanden/-spots werden aus einem 1D- bzw. 2D-Gel mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten und durch eine Protease im Gel verdaut. Die Gelbanden sollten in staubfreie (neue) 1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Greiner sind unserer Erfahrung nach am besten geeignet) überführt werden und mit dem Skalpell in kleine Würfel von 1-2 mm Kantenlänge geschnitten werden. Die Reaktionsgefäße-Gefäße sollten anschließend eindeutig beschriftetet werden. Wenig kreative Beschriftungen wie 1, 2, 3, etc. können zu Verwechslungen mit anderen Proben führen. Der in-Gel-Verdau der Gelbande mit Trypsin (andere Proteasen nach Absprache möglich), die Probenvorbereitung (Entsalzung über C18-Tip) und die massenspektrometrische Analyse inklusive Datenbanksuche werden von der CFH durchgeführt.

Der Erfolg einer massenspektrometrischen Identifizierung der Proteine hängt unter anderem von der verwendeten Gel-Färbemethode ab. Folgende Färbemethoden können verwendet werden:

a) konventionelle oder kolloidale Coomassie-Färbung:

Proteinbanden, die durch eine konventionelle oder kolloidale Coomassie-Färbung im Gel detektiert werden können, sind für MS-Analysen gut geeignet. Die Proteine lassen sich in der Regel problemlos durch einen Peptidmassenfingerprint oder eine ESI-LC-MS/MS-Analyse identifizieren, sofern die Proteinsequenz vorhanden ist. Viele konventionelle oder kolloidale Coomassie-Färbeprotokolle sind deutlich weniger sensitiv als eine Silberfärbung. Einige kolloidale Coomassie-Färbungen sind jedoch in ihrer Sensitivität der Silberfärbungen nahezu ebenbürtig (Detektionsgrenze ca. 15 ng). Ein Protokoll für eine sensitive kolloidale Coomassie-Färbung finden Sie im Downloadbereich.

b) Silberfärbung:

Falls eine Coomassie-Färbung keine ausreichende Sensitivität für eine Detektion der Proteine bieten sollte, ist die Silberfärbung eine Alternative. Die MS-Analyse von Proteinen aus silbergefärbten Gelen ist prinzipiell möglich, wenn die Vernetzung der Proteine mit der Polyacrylamid-Matrix des Gels durch Glutaraldehyd oder Formaldehyd vermieden wird. Ein geeignetes Protokoll finden Sie im Downloadbereich. Ebenso können Sie auch kommerziell erhältliche Kits, die MS-kompatibel sind, für die Silberfärbung verwenden. Die Sensitivität der Silberfärbung ist in der Regel deutlich höher als bei Coomassie-Färbungen (Detektionsgrenze ca. 1ng).

c) Fluoreszenzfärbungen:

Einige kommerziell erhältliche Fluoreszenzstains (z.B. Sypro Ruby, Flamingo oder Deep Purple) sind in ihrer Sensitivität der Silberfärbung ebenbürtig oder übertreffen sie sogar. Die Detektion der Proteine erfolgt hierbei über Imaging-Systeme wie den Typhoon-Imager. Die Vorteile bei der Verwendung dieser Stains gegenüber der Silberfärbung liegen neben der Sensitivität in einem deutlich höheren linearen Detektionsbereich (wichtig für quantitative Analysen) sowie in einer in der Regel besseren Kompatibilität mit der massenspektrometrischen Identifizierung. Ein Nachteil dieser Methode liegt darin, dass die  Banden bzw. Spots sich nicht direkt aus dem Gel ausschneiden lassen, sondern ein Ausdruck des am Fluoreszenzscanner erzeugten Bildes als Orientierungshilfe verwendet werden muss. Technisch lässt sich dieses Problem durch den Einsatz eines Spotpickers lösen, der die Spots aus dem Gel anhand des Fluoreszenzscanner-Bildes aussticht.

Welche Daten erhalte ich nach einer erfolgreichen Analyse meiner Probe?

Die massenspektrometrischen Daten werden in der Regel in elektronischer Form an die Kunden ausgehändigt. Für die Identifizierung von Proteinen und post-translationalen Proteinmodifikationen werden die Daten als Scaffold-Dateien zur Verfügung gestellt. Die zur Ansicht der Daten nötige Scaffold-Software (Proteome Software) kann als kostenlose Viewer-Version von der Homepage der Herstellerfirma heruntergeladen werden. Für Metaboliten-Profiling/Metabolomics-Analysen können die ausgewerteten Daten als Compound Discoverer-Datei zur Verfügung gestellt werden. Diese Software ist ebenfalls als kostenlose Viewer-Version von der Herstellerfirma (Thermo Fisher Scientific) erhältlich. Eine Kopie der massenspektrometrischen Roh-Daten wird ebenfalls an die Kunden übergeben, um den Kunden die eigene Sicherung ihrer Analysedaten zu ermöglichen  (siehe Benutzungs- und Entgeltordnung).

Kann ich Massenspektrometrie-Daten für Veröffentlichungen oder Präsentationen erhalten?

Bei Bedarf können Sie Massenspektren zu Publikationszwecken in gängigen Dateiformaten (z.B. tiff, jpeg, png, pdf oder pptx) erhalten. Angaben für den Material- und Methoden-Teil von Publikationen (Chromatographie- und MS-Parameter) können auf Anfrage ebenfalls zur Verfügung gestellt werden.