Service
Beratung
Um die jeweils geeignete Analysenmethode für Ihre Fragestellungen zu finden, bietet das Modul Massenspektrometrie der CFH (Core Facility Hohenheim) eine kostenlose Beratung für die massenspektrometrische Analysen von Proteinen und Metaboliten an. Die Beratung beinhaltet neben fachspezifischen Aspekten wie der Auswahl einer geeigneten Probenvorbereitung und der massenspektrometrische Analysemethode auch Fragen zum Zeitaufwand und zu den Kosten für das jeweilige Projekt. Sie können einen Beratungstermin telefonisch oder per E-mail vereinbaren. Die Preise für die massenspektrometrischen Serviceanalysen entnehmen Sie bitte der Benutzungs- und Entgeltordnung des Moduls Massenspektrometrie.
Massenspektrometrie
Die CFH bietet folgende Serviceanalysen im Bereich Massenspektrometrie an:
Peptide, Proteine & Proteomics
Molekulargewichtsbestimmung (MALDI-TOF, LC-ESI-MS)
Für eine hochauflösende Molekulargewichtsbestimmung zur Charakterisierung und Identifizierung von Peptiden und Proteinen mittels MALDI-TOF oder ESI-MS kann die Probe in getrockneter Form (lyophilisiert) oder in Lösung abgegeben werden. Bitte lesen Sie zuvor die Hinweise zur Probenvorbereitung für massenspektrometrische Analysen (siehe FAQ).
PMF (Peptid-Massen-Fingerprint)-Analyse (MALDI-TOF)
Über einen PMF können Proteine aus 1D- und 2D-Gelen bzw. 2D DIGE-Gelen identifiziert werden. Bitte verwenden Sie für die Färbung der Gele eine Methode, die mit der anschließenden massenspektrometrischen Analyse kompatibel ist. Hinweise zu geeigneten Färbemethoden für Gele finden sie unter FAQ. Die Gele können zusammen mit einem Probenformular in der CFH abgeben werden. Bitte fügen Sie dem Probenformular ein Bild des Gels bei, auf dem die zu analysierenden Banden/Spots markiert sind.
Die PMF-Analyse beinhaltet einen in-Gel-Verdau einer Gelbande oder eines Gelspots mit Trypsin (andere Proteasen nach Absprache möglich), die Entsalzung der Proben über ZipTips, die massenspektrometrische Analyse und eine Datenbanksuche (verfügbare Suchalgoritmen: Mascot, Sequest oder Andromeda). Darüber hinaus wird das PMF-Ergebnis über die Fragmentierung eines Peptides (MS/MS-Analyse) verifiziert.
Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen (nanoLC-ESI-MS/MS)
Für die Identifizierung von Proteinen aus komplexen Gemischen stehen zwei FT-ESI-Massenspektrometer (LTQ-Orbitrap XL, Q-Exactive Plus, beide Thermo Fisher Scientific) zur Verfügung, die jeweils an eine nano-HPLC-Anlage gekoppelt sind (Easy-nLC 1200 bzw. Easy-nLC 1000, Thermo Fisher Scientific). Beide FT-ESI-Massenspektrometer besitzen eine hohe Sensitivität und eine sehr hohe Massengenauigkeit, was eine eindeutige Identifizierung und die Quantifizierung von Proteinen erleichtert. Für eine Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen in Proben mit geringer oder mittlerer Komplexizität (≤ 1000 Proteine) sind in der Regel ESI-MS-Analysen mit HPLC-Gradienten von ≤ 2 h ausreichend. Eine Identifizierung und relative Quantifizierung von Proteinen in hochkomplexen Proben die mehrere tausend Proteine beinhalten („Proteomics“), erfordert längere HPLC-Gradienten (≥ 2 h) und ein Massenspektrometer mit hoher Massengenauigkeit und Scangeschwindigkeit. Hierfür steht ein Q-Exactive Plus ESI-MS zur Verfügung, das im Vergleich zum Orbitrap XL-System über eine höhere Scangeschwindigkeit und höhere Massengenauigkeit der MS/MS-Spektren verfügt, was zu einer höheren Anzahl von identifizierten/quantifizierbaren Proteinen in komplexen Proben führt.
Die Identifizierung der Proteine im Anschluss an die massenspektrometrische Analyse erfolgt über eine Datenbanksuche, die mit verschiedenen Suchalgorithmen (Mascot, Sequest, Andromeda) durchgeführt werden kann. Für die statistische Analyse von Proteomics-Daten stehen geeignete Softwarepakte (MaxQuant 1.5.5.1, Perseus 1.5.5.3, Progenesis LCMS 4.1.4) zur Verfügung. Der enzymatische Verdau der Proben, die massenspektrometrische Analyse und die Datenbanksuchen sind im Preis für die Analyse enthalten.
Posttranslationale Protein-Modifikationen (nanoLC-ESI-MS/MS)
Projekte zur Identifizierung und Quantifizierung posttranslationaler Modifikationen sollten mit uns vorab besprochen werden, da vor der massenspektrometrischen Analyse in manchen Fällen eine spezifische Anreicherung der modifizierten Peptide notwendig ist. Protokolle für die Anreicherung modifizierter Peptide sind zum Teil bereits etabliert (z.B. Phosphorylierung oder N-Glykosylierung) oder können nach Absprache erstellt werden. ESI-MS/MS-Analysen sind für die Suche nach posttranslationalen Modifikationen oft besser geeignet als MALDI-TOF-Analysen, da ESI-MS-Geräte direkt an ein chromatographisches Trennsystem gekoppelt werden können. Auf diese Weise können mehr Peptide je Protein identifiziert werden, was eine Identifizierung von modifizierten Peptiden wahrscheinlicher macht. Der CFH stehen für diese Analysen zwei FT-ESI-Massenspektrometer (Q-Exactive Plus, LTQ-Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific) zur Verfügung, die jeweils mit einer nano-HPLC-Anlage (EasyLC 1000, Thermo Fisher Scientific; nanoUPLC, Waters) gekoppelt sind und die Detektion von modifizierten Peptiden mit hoher Sensitivität und Massengenauigkeit ermöglichen. Der enzymatische Verdau, die massenspektrometrische Analyse und die Datenbanksuchen für die Identifizierung der modifizierten Peptide sind im Preis für die Analyse enthalten.
Gezielte Quantifizierung von Proteinen durch PRM-Experimente (nanoLC-ESI-MS/MS)
Eine gezielte Quantifizierung von Proteinen kann am Q-Exactive Plus Massenspektrometer mittels PRM (Parallel Reaction Monitoring) durchgeführt werden. Im Unterschied zu SRM (Selected Reaction Monitoring)-Experimenten werden hierbei alle Fragmentionen des Ziel-Peptides parallel einem Scan mit hoher Auflösung detektiert. Dabei können Peptide mit vergleichbarer Sensitivität detektiert werden wie in einem SRM-Experiment. Für ein PRM-Experiment muss nur das exakte m/z-Verhältnis des Ziel-Peptides bekannt sein, was das experimentelle Design einfacher macht als bei einem SRM-Experiment. Der enzymatische Verdau der Proben und die massenspektrometrische Analyse sind im Preis für die Analyse enthalten.
Für die Durchführung von PRM-Experimenten benötigen wir die Informationen, welche Proteine quantifiziert werden sollen. Die Auswahl geeigneter Peptide für die Quantifizierung kann auf Basis eines theoretischen Verdaus des Proteins erfolgen. Welche Peptide und Fragmentionen letztendlich für die Quantifizierung herangezogen werden, kann im Anschluss an die massenspektrometrische Analyse anhand der Fragmentierungsspektren des Zielpeptides entschieden werden. Eine absolute Quantifizierung ist ebenfalls möglich, erfordert aber die Erstellung einer Kalibriergeraden. Hierfür wird das Ziel-Peptid in Reinform (z.B. durch eine Peptidsynthese) benötigt.
Metabolite & Metabolomics
Die massenspektrometrische Analyse von unterschiedlichen Metaboliten (z.B. Lipide, Kohlenhydrate, Polyphenole, etc.) verschiedenen Ursprungs (z.B. Pflanzenmaterial, Zellkultur, tierisches Gewebe, etc.) erfordert jeweils eine spezifische Probenvorbereitung. Die Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse von Metaboliten muss daher von den Nutzern selbst durchgeführt werden. Die CFH kann bei der Erstellung von geeigneten Protokollen für die Probenvorbereitung beratend zur Seite stehen.
Molekulargewichtsbestimmung (MALDI-TOF, LC-ESI-MS)
Für eine hochauflösende Molekulargewichtsbestimmung zur Charakterisierung und Identifizierung von kleinen, organischen Moleküle (Metaboliten, etc.) mittels MALDI-TOF oder ESI-MS kann die Probe in getrockneter Form (lyophilisiert) oder in Lösung abgegeben werden. Bitte lesen Sie zuvor die Hinweise zur Probenvorbereitung für massenspektrometrische Analysen (FAQ). Sofern die Proben bereits mittels HPLC gereinigt wurden, kann die Molekulargewichtsbestimmung über Direktinfusion am Q-Exactive Plus ESI-Massenspektrometer erfolgen. Hierfür sollten die Proben idealerweise in 50% Acetonitril / 0,1% Ameisensäure (v/v) oder 50% Methanol / 0,1% Ameisensäure (v/v) gelöst sein. Als Alternative zu einer Direktinfusion kann eine Molekulargewichtsanalyse am Q-Exactive Plus ESI-Massenspektrometer über eine HPLC-Trennung an der 1290 Infinity UHPLC-Anlage erfolgen.
Gezielte Quantifizierung von Metaboliten durch SRM-Experimente
Für eine gezielte Quantifizierung von Metaboliten mittels SRM (Selected Reaction Monitoring) steht ein 5500 QTRAP-Massenspektrometer (AB SCIEX) zur Verfügung, das zusammen mit einer 1290 Infinity UHPLC (Agilent) betrieben wird. Für SRM-Experimente müssen die Masse der Peptide oder der Metaboliten sowie die Massen mehrerer Fragmentionen des Metaboliten bekannt sein. Mit Hilfe dieser Informationen lassen sich die gesuchten Metaboliten auch in einer komplexen Probe sehr sensitiv detektieren und quantitativ erfassen, da der chemische Hintergrund durch die Verwendung der Quadrupole als Massenfilter reduziert werden kann.
Für die Durchführung dieser Experimente benötigen wir die Informationen welche Metaboliten quantifiziert werden sollen, d.h. die exakten m/z-Verhältnisse dieser Substanzen und idealerweise auch die Information welche Fragmentionen bei der Fragmentierung dieser Substanzen entstehen (falls über Literaturrecherche oder eigene Experimente bekannt). Eine absolute Quantifizierung von Metaboliten ist ebenfalls möglich, erfordert aber die Erstellung einer Kalibriergeraden. Hierfür werden die zu quantifizierende(n) Substanz(en) in Reinform benötigt.
Metaboliten-Fingerprint/Metaboliten-Profiling/Metabolomics
In einer massenspektrometrischen Metabolomics-Analyse wird in einem umfassenden, nicht-selektiven Ansatz zunächst versucht, möglichst viele Metaboliten in einem biologischen System zu identifizieren und anschließend unter verschiedenen physiologischen Bedingungen des Systems relativ zu quantifizieren. Für Metabolomics-Experimente steht ein Q-Exactive Plus ESI-Massenspektrometer gekoppelt mit einer 1290 UHPLC-Anlage zur Verfügung. Massenspektrometrische Metabolomics-Analysen erzeugen große Datensätze, die statistisch ausgewertet werden müssen, um signifikante Veränderungen auf Metabolom-Ebene zu identifizieren. Hierfür stehen geeignete Softwarepakete (Compound Discoverer 2.0, XCMS online Version v3.5.1) zur Verfügung.
Aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Struktur (z.B. Lipide und Monosaccharide) besitzen Metabolite ein unterschiedliches Extraktionsverhalten und unterschiedliche chromatographische Eigenschaften. Dies macht es schwierig, alle Metaboliten eines biologischen Systems in einer massenspektrometrischen Analyse gemeinsam zu erfassen. Daher wird je nach Fragestellung häufig das Augenmerk auf bestimmte Stoffgruppen gelegt, die sich gemeinsam aus dem Probenmaterial extrahieren und in einer massenspektrometrischen Analyse erfassen lassen. Diese fokussierte Art der Analytik wird auch als „Metaboliten-Profiling“ bezeichnet. Ein analytischer Ansatz, der alle Metaboliten einer Probe umfasst („Metabolomics“), erfordert den Einsatz unterschiedlicher Extraktionsmethoden und verschiedener komplementärer Analysemethoden (GC-MS, LC-MS, NMR). Bitte vereinbaren Sie vorab einen Besprechungstermin, um eine geeignete Probenvorbereitung bzw. Analysemethode für Ihr Metabolomics- oder Metaboliten-Profiling-Experiment festzulegen.
Quantitative 2D Elektrophorese (2D DIGE)
Die differenzielle fluoreszierende 2D-Gelelektrophorese (2D DIGE) ist eine zu einer quantitativen LC-MS-Analyse komplementäre Methode, die eine direkte Analyse von Unterschieden in der Proteinzusammensetzung verschiedener Proben ermöglicht. Hierfür werden die Proteine jeder Probe vor Beginn der Elektrophorese kovalent mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert und anschließend zusammen in einem 2D-Gel analysiert. Die Vorteile liegen in einer hohen Sensitivität (0,1-1 ng Protein bei „minimal labeling“) und dem hohen dynamischen Detektionsbereich, der 3-5 Größenordnungen umfasst. In der Regel wird neben den zu vergleichenden Proben noch ein interner Standard mit einem dritten Fluoreszenzfarbstoff markiert, um bei einer entsprechenden Anzahl von Wiederholungen Gel-zu-Gel-Vergleiche zu ermöglichen und die technische Varianz so gering wie möglich zu halten. Nach einer statistischen Analyse der Gele, können differenziell exprimierte Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden.
In der CFH stehen die Gerätschaften für 2D DIGE Experimente (2D Elektrophorese-Apparatur, Typhoon-Imager, SameSpots-Software (siehe Geräteausstattung) zur Verfügung. Die Durchführung der Experimente und die statistische Auswertung der Gele kann nicht durch die CFH durchgeführt werden, sondern erfolgt durch die Nutzer. Die Mitarbeiter der CFH können Hilfestellung bei Fragen zur Probenvorbereitung, der Bedienung des Typhoon-Imagers oder der statistischen Auswertung mit der SameSpots-Software geben. Die anschließende massenspektrometrische Analyse differenziell exprimierter Proteine kann als Serviceleistung erfolgen (s. oben).